Chapitre 1. Propriétés de l'ADN, caractérisation physique des génomes 1
1. Rappels sur la structure des génomes et de l’ADN 2
a) Implications pratiques du surenroulement de l'ADN 2
b) Implications biologiques du surenroulement de l'ADN 4
2. La séparation des composants des génomes 8
a) Séparation en fonction de la taille 8
b) Séparation en fonction de la forme 12
c) Séparation en fonction de la composition en bases 13
d) Séparation de molécules selon leur nature 14
3. La fragmentation spécifique des génomes par des enzymes de restriction 15
4. Le repérage de séquences spécifiques par hybridation 22
a) Hybridation sur support : techniques de Southern et de northern 24
b) A propos des sondes 28
c) Marquage 30
5. L’amplification in vitro de séquences spécifiques par PCR 34
6. Quelques exemples d’utilisation de ces techniques en dépistage génétique 37
a) Détection de mutations ponctuelles 37
b) Sondes internes et sondes externes au gène 39
c) Détection de gènes ou d’organismes 41
d) Cas des séquences répétées 42
Chapitre 2. Vecteurs de clonage et analyse des banques 47
1. Nécessité et principe du clonage 49
2. Vecteurs de clonage 51
a) Les vecteurs plasmidiques 51
b) Les vecteurs dérivés du phageM3. 56
c) Les vecteurs dérivés du phage λ. 57
d) Les cosmides. 61
e) Les chromosomes artificiels bactériens (BAC = Bacterial Artificial Chromosome). 63
f) Vecteurs plasmidiques de Saccharomyces cerevisiae 64
g) Les chromosomes artificiels de levure (YAC = Yeast Artificial Chromosome). 66
3. Types de banques 70
a) Type de vecteur et taille de la banque 70
b) Source de l’ADN et type de banque. 70
4. Criblage des banques. 75
a) Criblage biologique des recombinants. 75
b) Criblage par hybridation. 75
c) Criblage immunologique : hybridation sur colonie et « western blot » 77
d) Clonage par marche sur le chromosome. 78
Chapitre 3. Analyse et modification de la séquence des gènes 83
1. Séquence de l’ADN 84
a) La méthode chimique ou méthode de Maxam-Gilbert. 84
b) La méthode enzymatique « de terminaison di-deoxy » de Sanger 85
2. Analyse des séquences. 89
a) Assemblage des séquences. 89
b) Recherche d’une phase ouverte de lecture. 89
d) La recherche de similitudes. 91
3. Mutagenèse dirigée des séquences (site directed mutagenesis ou SDM). 95
Chapitre 4. Cartes génétiques et cartes physiques 101
1. Les cartes génétiques, ancienne et nouvelle manière 105
a) Polymorphisme de longueur des fragments de restriction (ou RFLP en anglais)
b) Microsatellites 113
c) Polymorphisme mononucléotidique ou SNP (single nucleotide polymorphism) 116
2. Les cartes physiques 117
a) Les cartes de restriction 117
b) Le séquençage total des génomes 121
c) L’émergence d’une industrie autour de la génomique. 124
Chapitre 5. Contrôle de l'expression génétique 127
1. Contrôle de la transcription chez les procaryotes 129
a) L’initiation de la transcription 129
b) La répression de l’initiation (contrôles négatifs) 132
c) L’activation de la transcription (contrôles positifs) 136
d) La terminaison de la transcription. 138
e) Couplage transcription-traduction : Polarité et atténuation. 139
f) Les vecteurs d’expression procaryotes 142
g) Quelques problèmes rencontrés lors de l’expression hétérologue 144
2. Contrôles transcriptionnels chez les eucaryotes. 145
a) La machinerie 145
b) Les transcrits. 148
c) Les vecteurs d’expression. 152
Chapitre 6. La transformation des cellules et des organismes 153
1. Les méthodes d’introduction de l’ADN 154
a) Bactéries
b) Levures, Champignons 158
c) Cellules végétales et plantes 161
d) Cellules animales et animaux 163
2. Etat et expression des transgènes 166
a) Chez les bactéries et les levures 166
b) Chez les plantes et les animaux 166
Annexe 1. Publications citées dans le texte 171
Annexe 2. Le génie génétique : Quelques découvertes et techniques 171
Annexe 3. Le code génétique.

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